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影响细 胞生长的几点因素

2019/01/12

影响细 胞生长的几点因素,


摘要:细胞在体外进行培养,失去了 机体的调节和控制,因此,除满足营养的要求外,还必须 使细胞生存环境昼接近活体的环境.外环境 的培养条件如温度、渗透压、酸碱度 等均能影响细胞的生长.


一、温度:


 一般哺 乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃.温度过 高或过低都会影响到细胞的生长.细胞耐 受低温的能力比抗热的能力强,在低温下,细胞的 代谢活力及核分裂降低.温度低于0℃时,虽影响细胞代谢,但并无伤害作用.把细胞置于23~25℃时,细胞仍能生存和生长,但速度减缓,不过,鱼类细 胞的适宜培养温度为23~25℃.若温度过低,在降到冰点以下时,细胞因 胞外水和胞质结冰而受损死亡,但若向 培养基中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO)等保护剂,封入安瓿中后,置于液氮或低温冰箱(-70℃)中,可起保护作用,此时细胞可而耐受-70℃以下温度,能长期储存,解冻后细胞复苏,仍能继续生长增殖,细胞物 性状不受任何影响.此为保 存细胞的主要手段.


 高温对细胞培养不利.细胞在39~40℃培养1h,会受到一定损伤,但仍有可能恢复,但不能 忍受温度再升高2℃,持续数小时,即在41~42℃培养1h,细胞操作严重,温度到43℃以上时 细胞多数被杀死.高温主 要引起酶的灭活、类脂质破坏、核分裂的破坏,产生凝 固酶使细胞发生凝固,另外使蛋白质变性.因此,体外培 养细胞时一定要避免高温.


二、渗透压:


 细胞在 高渗透溶液中低渗溶液中,可以立 即发生皱缩或肿胀、破裂.所以,渗透压 是体外细胞培养的重要条件之一.哺乳动 物和其他动物组织细胞体外孙女培养的渗透压的维持主要与NaCl有关,但不能 忽视其他电解质与渗透压的关系,渗透压 与单位体积溶剂内溶质的分子数和离子娄成正比.为此,按一定 比例控制培养基中离子平衡,维持正 常渗透压是很重要的.这不仅 是为了维持细胞张力,而且是 为了调节细胞的代谢.因为细 胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送(如氨基酸、糖等),直接影 响细胞基本合成系统.


 理想的 渗透压因细胞的类型及种族而异,人血浆渗透压为290mmol/L,被视为 是体外培养人类细胞的理想渗透压.哺乳动 物细胞的渗透压一般为290~300mmol/L.人胚肺成纤维细胞为250~325mmol/L,鼠细胞则为310mmol/L左右.在实际应用中,260~320mmol/L的渗透 压可适于大多数细胞.常用培 养基的渗透压值见表2-3.


三、气体环境和PH值:


体外培 植细胞需要理想的气体环境,氧和二 氧化碳石细胞生存必需的条件之一.


1、氧:


氧参加 细胞的三羧酸循环,产生能 量以供应给细胞生长、增殖和 合成各种所需成分.有些细 胞在低氧条件下,可借糖酵解取得能量,单多数 细胞低氧时不能生存.氧张力 通常维持在略低于大气状态,若氧分 压超过大气中氧的含量可能对有些细胞有害.


2、二氧化碳:


 采用开放式培养时(碟或培 养瓶松盖培养或培养板培养),一般要把细胞置于95%空气加5%二氧化 碳的混合气体环境中.CO2既是细胞的代谢产物,又是细 胞生长所必需的成分,并与维持培养基的pH值有关.在密闭瓶中CO2浓度偏低的情况下,细胞容易生长,一般不能低于1%,否则有损细胞.CO2增加将使pH值下降.


3、pH值:


 大多数细胞适于在pH7.2~7.4条件下生长,低于pH6.8或高于pH7.6对细胞有害,甚至退 变或死亡各种细胞对pH值的要求不尽相同.一般原代培养细胞对pH值的碱 性的耐受比对酸性的耐受差,偏酸的 环境比偏碱的环境对细胞生长有利.为了维 持培养环境恒定的pH值,多采用 在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂的方法.磷酸缓冲剂中的NaHCO3可供给CO2,但CO2易于逸出,故只适 用于封闭式培养.若开放 式培养还是置于含有5%CO2的气体环境中为宜.为克服NaHCO3调整的麻烦,也可用 羧基哌唪硫磺酸(N-2 –hydroxyethyl piperazine-N’ethanesulfonic acid,Hepes),它对细胞无毒性,主要作用是防止pH值迅速变动,在开瓶 通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值.


四、无毒和无菌:


 无毒和 无菌是体外培养细胞的首要环境条件.细胞在深入活体内,偶尔有 细菌或有害物质入侵,因体内 有强大的解毒系统和免疫系统,可将其解毒或清除,而不易受损害.但在离体的环境中,失去了防御系统,一旦有 害物质入侵或细菌污染,可导致细胞死亡,前功尽弃.如培养瓶、培养皿、支持物、培养基、瓶塞上有细胞毒性,在培养 过程中可导致细胞死亡因此,在选用这些器皿、材料时要注意,若这些 物品消毒不彻底,带菌或 操作过程不小心使细胞污染,也会导致细胞死亡.若出现交叉污染,可使实 验室原来的细胞系失去原有特性,应引起足够的重视.


五、辐射线和超声波:


1、可见光


可见光的波长是390~780nm.可见光 的各种有色光能引起细胞退变,延长核分裂的间期,还可显 著降低细胞的附壁能力.因此,体外培 养细胞应避免日光直接照射,最好在 黑暗中进行培养或短期存放.


2、紫外线


 弱紫外 线下耐受能力强的细胞变化不大,但对敏 感的细胞有损害.紫外线强时,就分离的细胞显示:不能进 行完全的有丝分裂;在有丝 分裂时增加了脱水收缩;在有丝 分裂时细胞质的起泡减少.Elrlich腹水癌 细胞经紫外线照射后,用激光 共聚焦扫描显微镜观察发现被照射表面形成水泡,随后细胞膨胀,损害也渐变严重.


3、放射线


X射线对 细胞有明显损伤.B射线可 影响细胞核的分裂.R射线使 核分裂数减少并出现不正常的核分裂,可使细胞死亡.


4、超声波


在超声波振动下,细胞很快会破裂,开始是 胞质发生紊乱的流动,原生质 胶体结构也有明显变化,若停止 超声波振动可恢复.细胞致 死的原因是由于产生空化作用所致.当超声波在2.5W/c㎡时,细胞受损,染色体发生畸变,首先发 生畸变的是核染色体.


六、细胞接种密度:


 在体外培养细胞中,细胞接 种数对细胞的生长有影响,适宜的接种密度,可以促使细胞增殖,接种密 度太低或太高都不利于细胞的生长增殖.如果培 养基与细胞的容积比例大于2000:1,生长物 质弥散到细胞外过多,将使细 胞内浓度低于最小限度的浓度,此时细胞不能再增殖,培养基的pH值变碱,抑制细胞生长,细胞变圆不能贴壁,甚至引起细胞死亡等.如果接种密度太高,每个细 胞周围培养基的容积降至0.007㎜3以下,由于弥散率降低,细胞内 生物质的浓度增加,容易使 排出物或其他代谢产物达到饱和,能量来源也很快耗尽,因此也 会防碍细胞的增殖.


 如何选 择适宜的接种浓度要根据细胞的代谢和生长繁殖速度以及工作的需要而确定.一般来说,代谢旺盛、生长速度快的细胞(如肿瘤细胞),接种浓度宜偏低;而正常 组织细胞生长较慢,代谢不够旺盛,接种浓度可偏高;如果是 为了保种或不需急用,接种可偏低些;有时为 了便于观察细胞形态结构,接种浓 度也可适当降低.


七、容器转 动速度和悬浮搅动速度:


有时为 了研究的需要而将培养细胞在容器中进行旋转或搅动,如贴壁 细胞在旋转管中培养,使转鼓的转速提高,细胞增殖率随之提高.其原因 可能是转动使足够的营养物质流动和较充分的氧化作用之故.


 当悬浮 搅拌培养细胞时,搅拌速度既不能太快,也不能太慢.如果太慢,细胞易结团、下沉和贴壁,不利于 细胞在悬浮状态下增殖.如果太快,容易起泡沫,细胞易窒息致死,同时,强烈地 搅动易使细胞因机械损伤而破裂.所以选 择适宜的搅拌速度很重要.如BHK-21细胞的 搅拌适宜速度为460~330r/min;淋巴细胞(Raji细胞)株,在200r/min和400r/min(Namalva细胞)生长速度快,在80~1000r/min时既不结团,又不需要加抗泡沫剂,细胞生长仍然很快.各种细 胞的适宜搅拌速度不一致,通常与 细胞的特性和质量有关,应予以注意.


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